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| 產(chǎn)地 | 國內(nèi) |
| 品牌 | 上海滬崢 |
| 貨號 | HZS0254 |
| 用途 | 僅限科研 |
| 包裝規(guī)格 | 50T/盒 |
| 純度 | 詳詢客服% |
| CAS編號 | |
| 是否進口 |
產(chǎn)品名稱：
季節(jié)性甲型H1流感病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
1．常規(guī)程序
將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。*后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。
2．復(fù)性（退火）和延伸溫度
復(fù)性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。
3．反應(yīng)時間
變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當(dāng)延長。復(fù)性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。
平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹底。
5．PCR反應(yīng)液的配制
PCR反應(yīng)體系的配置方式有時也會影響反應(yīng)的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在*后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時，如果將反應(yīng)成分分開配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。
按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，*后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應(yīng)成分才會混合在一起。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后置入潔凈的1.5ml離心管中；
液體標本：取適量標本13000rpm離心2min，棄上清。
1.2 DNA提取
1) 對上述處理好的標本加入40ul 核酸提取液，100℃恒溫處理10分鐘，13,000 rpm離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2) DNA的提取也可以采用北京億森寶公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)代檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1
管陰性對照+1管陽性對照），體系配制如下表：
試劑
WSSV 反應(yīng)液
酶液
用量（樣本數(shù)為N）
20μl
1μl
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μl，加入相應(yīng)的
反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
5. 結(jié)果分析判定
結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置基線（baseline）：一般情況下，對ABI 7500、7700等儀器設(shè)為6-15cycle，對PE5700設(shè)為3-15cycle,對MJ Research Option2設(shè)為6-12cycle。特殊情況可對基線適當(dāng)調(diào)整。
設(shè)置閾值（threshold）:以閾值線剛超過陰性對照擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的zui高點。
結(jié)果判斷
陽性：檢測樣本Ct值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；
可疑：檢測樣本Ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實驗，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
陰性：檢測不到樣本Ct值或Ct值為40。
6. 對檢驗結(jié)果的解析
實驗室環(huán)境污染，試劑污染，標本交叉污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果。
7. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：擴增曲線無對數(shù)生長期或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯對數(shù)生長期，且Ct值≤32;
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。
季節(jié)性甲型H1流感病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）需要自備的器材：
1．儀器：分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL、20μL、200 μL、1000 μL）。
2．耗材：熒光 PCR 專用反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）、滅菌雙蒸水。
季節(jié)性甲型H1流感病毒檢測試劑盒（實時熒光法）1.模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用配套水生動物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。
2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進行）
剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-VH-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應(yīng)。
3. 擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
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